農(nóng)業(yè)部指定非洲豬瘟試劑盒使用說明書

（快提核酸擴(kuò)增試劑盒）

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：農(nóng)業(yè)部指定非洲豬瘟試劑盒（PCR熒光探針法） 英文名稱：Diagnostic Kit for African Swine Fever Virus （PCR Fluorescence Probing）

［預(yù)期用途］

本試劑盒主要用于檢測(cè)疑似感染豬抗凝血及臨床病料中的非洲豬瘟病毒（ASFV,African Swine Fever Virus）核酸，適用于非洲豬瘟病毒的檢測(cè)、輔助診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

【試劑盒組分】

1、試劑盒組成及貯藏條件

2、需自備材料：生理鹽水、無菌槍頭、熒光PCR專用反應(yīng)管、記號(hào)筆等。

【操作步驟】一、樣品制備

1、血液樣品：采集抗凝血（抗凝劑為EDTA）或血清樣品，編號(hào)備用。

2、組織樣品：采集脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、扁桃體等病變組織樣品或軟蜱0.1g（黃豆粒大?。?，眼科剪剪碎于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，再加1mL生理鹽水混勻，4°C條件下8000rpm/分鐘離心2分鐘，取上清液于滅菌離心管中，編號(hào)備用。

二、DNA提取

取反應(yīng)液A 20μL分別加入到新的1.5mL離心管，加入抗凝而或血清或組織上清液2μL混勻，室溫（20°C左右）靜置3分鐘，加入反應(yīng)液B 20μL,吹打混勻即可，若為抗凝全血，則需8000rpm/分鐘再離心2分鐘后做為待檢DNA溶液。

二、PCR擴(kuò)增

1、配液：取出PCR反應(yīng)液、酶混合液，在室溫完全融化后，充分混勻，瞬離，可將酶混合液全部取岀直接加入到PCR反應(yīng)液中，充分混勻，瞬離后按每份20μL分裝使用；或按照每份PCR反應(yīng)液17μL,酶混合液3μL的比例取一定的試驗(yàn)用量，混合兩種反應(yīng)液,瞬離后按照每份20μL分裝到專用熒光PCR 反應(yīng)管中，剩余試劑立即凍存；（操作過程要注意避光）

2、加樣擴(kuò)增：分別向上述PCR反應(yīng)管中加入5μL樣本 DNA或陰性對(duì)照或陽性對(duì)照，混勻并瞬離,放入熒光PCR儀上運(yùn)行以下程序：

步驟 條件 循環(huán)數(shù) UNG處理 50°C：2分鐘1 預(yù)變性 95°C：3分鐘1 預(yù)擴(kuò)増 95°C：8秒55C：8秒5 PCR擴(kuò)增 95°C：8秒55°C：8秒40

熒光通道選擇FAM,在40循環(huán)階段每個(gè)循壞的55°C時(shí)收集熒光信號(hào)。設(shè)置擴(kuò)增體系為25μL,同時(shí)要選擇 passive reference 和 quencher 為 none 的模式。

(注:若熒光PCR儀(如ABI7500)按說明書中的反應(yīng)程序設(shè)置后因持溫時(shí)間短無法運(yùn)行,可將預(yù)擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增條件變更為95°C：5秒55°C：30秒。)

【結(jié)果判定】1、基線和閾值設(shè)定；基線調(diào)整取6-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值設(shè)定以閾值線剛好超過陰性對(duì)照檢測(cè)熒光曲線的最高點(diǎn)為原則。

2、質(zhì)量控制：反應(yīng)結(jié)束后，陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)無特定的擴(kuò)增曲線，Ct值為＞38或無；陽性對(duì)照 的Ct值應(yīng)≤30.0,且明顯的擴(kuò)增曲線；否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

3、樣品判定：待檢樣品熒光信號(hào)有指數(shù)型增加，且結(jié)果顯示Ct值<35.0,報(bào)告為陽性；未檢測(cè)到Ct 值或Ct值＞38或無明顯擴(kuò)增曲線，則樣品判定為陰性。35≤Ct值≤8時(shí)，復(fù)檢一次，重復(fù)結(jié)果為陽性者判定為陽性，否則判定為陰性。

【注意事項(xiàng)】1、實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本試劑盒說明書，嚴(yán)格按照操作步驟執(zhí)行，在操作過程中對(duì)時(shí)間、試劑體積等精確控制可以獲得最好的結(jié)果。

2、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)定分區(qū)管理。各區(qū)間人員、器材、試劑及空氣流向應(yīng)有產(chǎn)格要求。

3、有關(guān)耗材確保潔凈、無菌，核酸提取完成后盡快進(jìn)入下一步試驗(yàn)或冷凍保存。

4、預(yù)混后的試劑應(yīng)盡量在短期內(nèi)使用完畢，戶外使用應(yīng)在加冰袋的泡沫盒保存，每日試驗(yàn)完畢應(yīng)及時(shí)冷凍保存。

5、對(duì)于熒光PCR管要避免徒手或使用過的手套接觸，檢測(cè)過程中使用不帶熒光物質(zhì)一次性乳膠手套。

6、凍存試劑使用前應(yīng)于室溫下完全融化，充分混勻，瞬時(shí)離心使液體完全沉于管底。

7、樣品、陰性對(duì)照封蓋后，在通風(fēng)環(huán)境添加陽性對(duì)照并及時(shí)封蓋，避免組分間及氣溶膠等假陽性污染。

8、擴(kuò)增反應(yīng)完畢后的PCR管嚴(yán)禁開蓋,應(yīng)和試驗(yàn)產(chǎn)生的其它廢棄物一起及時(shí)收集,遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行無害化處理。

【規(guī)格】50頭份/盒。

【貯藏與有效期】-20°C以下避光保存，有效期12個(gè)月。

僅供獸醫(yī)診斷使用